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生物樣品的熒光觀察
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、初掌握熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理、使用方法及其在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用。
2、掌握生物材料的熒光染色和活體熒光蛋白的觀察方法。
3、了解激光共聚焦的原理。
二、實(shí)驗(yàn)原理
1、某些物質(zhì)經(jīng)短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量除部分轉(zhuǎn)換為熱量外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見光稱為熒光。細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)短波光照射后，可以發(fā)出自發(fā)熒光。在生物學(xué)研究中，能將發(fā)熒光的有機(jī)化合物-熒光染料與特定的細(xì)胞組分相結(jié)合，通過(guò)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光對(duì)細(xì)胞組分進(jìn)行定性和定位。
2、生物樣品的熒光觀察采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。熒光顯微鏡以波長(zhǎng)較短的光為光源，照射被檢樣品，激發(fā)被檢物品內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出可見的熒光，通過(guò)物鏡和目鏡放大成像。激光共聚焦顯微鏡也是來(lái)觀察樣品中熒光分布狀況的。激光共聚焦顯微鏡是以激光為光源，在某一瞬間只用很小一部分光照明，通過(guò)檢測(cè)器的一個(gè)小孔或裂縫后成像，保證只有來(lái)自該焦平面的光成像，而來(lái)自焦平面外的散光則被小孔和裂縫擋住，成像異常清晰。此外，激光共聚焦顯微鏡可以在同一樣品的不同焦平面進(jìn)行掃描得到不同焦平面的圖像，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。
3、本實(shí)驗(yàn)中微絲的熒光觀察采用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin），鬼筆環(huán)肽可以專一的結(jié)合在聚合狀態(tài)的肌動(dòng)蛋白絲上，起到穩(wěn)定微絲的作用。細(xì)胞核的觀察用DAPI（diamidino-2-phenylindole）染色。DAPI能與DNA雙螺旋的凹槽部分相互作用，從而與DNA雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰358nm，而散射峰是461nm。而植物細(xì)胞的花粉管、篩板和胞間連絲含有胼胝質(zhì)成分，經(jīng)苯胺藍(lán)染色后，用紫外光激發(fā)，可以發(fā)出黃綠色熒光。
4、激光共聚焦掃描顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）原理：用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描(轉(zhuǎn)載于:www.hnNscy.CoM:生物熒光)激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器
1、材料：煙草懸浮細(xì)胞、擬南芥、蠶豆
2、試劑：3.6%多聚甲醛、Pipes緩沖液、100nmAlexaFluo488phalloidin、DAPI染色液、0.1%苯胺藍(lán)
3、儀器：Olympus熒光顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、載玻片、蓋玻片、鑷子
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
（一）熒光標(biāo)記觀察煙草懸浮細(xì)胞微絲骨架的分布
1、煙草懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)。
MS培養(yǎng)基的基本成分：
MS無(wú)機(jī)鹽+KH2PO4200mg/L；煙酸10mg/L；維生素B11mg/L；
肌醇100mg/L；2，4-D0.1mg/L；蔗糖30g/L
在室溫、黑暗生長(zhǎng)，120~130rpm
2、固定：取300μl細(xì)胞液放入離心管中，靜置沉降，3000rpm離心30s，吸出培養(yǎng)基，加入500μl3.6%多聚甲醛，固定20min。再吸出固定液，用Pipes緩沖液清洗三次，每次5min。
3、染色：3000rpm離心1min，吸凈緩沖液，加入100nmAlexaFluo488phalloidin50μl，37℃染色20min，洗去染色液，加入50μl緩沖液，吸取10μl直接進(jìn)行封片。
4、熒光顯微鏡觀察：在藍(lán)光激發(fā)下進(jìn)行觀察，檢測(cè)的發(fā)射光波長(zhǎng)為510-530nm。
（二）DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核DNA
用鑷子夾住三朵不同發(fā)育時(shí)期的擬南芥的花，將花粉黏在載玻片上，加入20ulDAPI染色液染色3-5min。在紫外激發(fā)下用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)發(fā)射光為461nm。
（三）、苯胺藍(lán)染色觀察胞間連絲
撕取蠶豆葉片下表皮，用20μl0.1%苯胺藍(lán)染色3-5min后紫外激發(fā)下鏡檢。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（一）熒光標(biāo)記觀察煙草懸浮細(xì)胞微絲骨架的分布
圖1煙草懸浮細(xì)胞微絲骨架形態(tài)（phalloidin標(biāo)記，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
熒光顯微鏡下可以觀察到，煙草懸浮細(xì)胞呈現(xiàn)出不規(guī)則形狀，原因是培養(yǎng)之前去除了細(xì)胞壁。再培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞壁再生，會(huì)有不同的形態(tài)。細(xì)胞中有一條綠色的絲狀結(jié)構(gòu)，即為微絲，細(xì)胞和附近顏色較深。微絲在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)三維空間分布，細(xì)胞核附近分布較多，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，解釋為微絲在細(xì)胞內(nèi)起到固定位置的作用。
（二）DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核DNA
圖2擬南芥花粉粒（DAPI染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A三細(xì)胞型花粉粒B兩細(xì)胞型花粉粒
擬南芥的花粉粒呈微藍(lán)色的透明狀，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以觀察到最多3個(gè)細(xì)胞核。
（三）、苯胺藍(lán)染色觀察胞間連絲
圖3蠶豆葉下表皮細(xì)胞胞間連絲（苯胺藍(lán)染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A胞間連絲B熒光標(biāo)記淬滅后的觀察效果
在紫外光激發(fā)的熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞間連絲位于相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞壁上，呈現(xiàn)出綠色熒光。
六、分析與討論
1、在熒光標(biāo)記觀察煙草懸浮細(xì)胞微絲骨架的分布實(shí)驗(yàn)中，在藍(lán)光激發(fā)下，清晰的看到了發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞骨架。同時(shí)，觀察到制片的背景較明亮，原因可能是phalloidin
染色后清洗不夠充分，導(dǎo)致殘留的phalloidin粘在載玻片上，發(fā)出熒光。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)中在最后取樣階段細(xì)胞堆疊太多，導(dǎo)致微管組織顯色重疊，觀察不便。
2、在DAPI染色檢測(cè)擬南芥花粉的實(shí)驗(yàn)中，看到部分花粉粒中都有三個(gè)明亮的發(fā)光點(diǎn)，判斷為三個(gè)細(xì)胞核。此外，還看到一些僅有兩個(gè)細(xì)胞核的花粉粒。我們知道成熟的擬南芥花粉為三細(xì)胞型。而兩細(xì)胞的花粉粒可能是尚未成熟或在當(dāng)前視野下只能看兩個(gè)核。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的三核并不明顯，更多的是以雙核為主，三核現(xiàn)象也更多時(shí)候第三核并不完整，總結(jié)原因估計(jì)是在取樣階段采集的是尚未展開的花朵。
3、在苯胺藍(lán)染色觀察胞間連絲的實(shí)驗(yàn)中，在紫外激發(fā)下，看到蠶豆下表皮細(xì)胞呈藍(lán)色，其中較為明亮的光點(diǎn)即為胞間連絲。但在觀察中，發(fā)現(xiàn)熒光很迅速的發(fā)生淬滅，給觀察和拍照帶來(lái)了很大困難。在本實(shí)驗(yàn)中選擇兩人配合以解決問(wèn)題。但是，通過(guò)查閱相關(guān)資料后，建議在制片的時(shí)候，加入適量的抗淬滅劑如p-phenylenediamine(PPD)、0.2%DABCO，來(lái)減慢熒光的淬滅速度。
七、思考題
1、結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，總結(jié)用于熒光觀察樣品的制備方法
根據(jù)生物樣品產(chǎn)生熒光的方式不同，往往分為以下三類：
（1）自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光或直接熒光。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光；在400nm左右的激發(fā)光照射下，可直接觀察細(xì)胞壁纖維素所產(chǎn)生的綠色熒光等；一些具有GFP基因的生物編碼出的蛋白能發(fā)出綠色熒光。
對(duì)于這類樣品的觀察，我們可以直接取材在熒光顯微鏡下觀察，但要根據(jù)樣品的熒光特性選取合適的激發(fā)光和發(fā)射光。
（2）次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外光照射后，并不能發(fā)出熒光，但是它可以吸收某些熒光染料并與與之結(jié)合，也可以產(chǎn)生熒光，這種稱為次生熒光（或間接熒光）。如鬼筆環(huán)肽、DAPI等。
該方法就是采用常用的熒光染料染色，也是本實(shí)驗(yàn)三種樣品的熒光標(biāo)記方法。首先應(yīng)該根據(jù)樣品選取能夠與之特異性結(jié)合的熒光染料，比如鬼筆環(huán)肽結(jié)合微絲、DAPI結(jié)合核DNA、甲苯胺藍(lán)結(jié)合胞間連絲的胼胝質(zhì)。隨后經(jīng)染色處理，根據(jù)染料的特異性選取適當(dāng)波長(zhǎng)的激發(fā)光和發(fā)射光在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
（3）免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理，將熒光染料與抗體結(jié)合，然后將這種標(biāo)記熒光染料的抗體再與相應(yīng)抗原結(jié)合，即形成抗原、抗體復(fù)合物。經(jīng)一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后，即可發(fā)射出熒光。以此辨認(rèn)抗原在組織細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。這種方法被稱為免疫熒光或熒光抗體法。
該方法是一種更為間接地觀察生物樣品熒光的方法。其關(guān)鍵在于抗原-抗體反應(yīng)的選取與設(shè)計(jì)。可以采用直接染色法，就是將熒光素直接與第一抗體結(jié)合，然后進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)；也可采用間接染色法，即將熒光素與第二抗體結(jié)合，此法需要進(jìn)行兩次抗原-抗體反應(yīng)。觀察時(shí)也需要注意調(diào)好光源，即選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)的激發(fā)光和發(fā)射光的選取。
此外，激光共聚焦掃描顯微鏡也可用來(lái)觀察樣品中熒光分布狀況，其可以在同一樣品的不同焦平面掃描得到圖像，通過(guò)計(jì)算機(jī)重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)，成像清晰，具有立體感。
參考文獻(xiàn)
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【3】王幼群，陳立群，劉毅敏，杜中.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程.中國(guó)農(nóng)業(yè)生物學(xué)生物學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研組，2009
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