分子生物學實驗講義示例

　　CTAB法提取植物基因組DNA

　　【實驗背景】

　　高等動物，高等植物的基因組相當龐大，一些物種的特定基因組包括了該物種生長，發育，繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細胞基因組的結構，組成，以及表達調控的研究是至關重要的，而提取要求是獲得純度高和收得率高。

　　【實驗目的】

　　1、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法；

　　2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機等使用操作技術。

　　【實驗原理】

　　植物組織采用液氮研磨達到細胞破碎，細胞內容物采用CTAB分離蛋白質、多糖，再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化，RNA由RNA酶消化，分離出的DNA由無水乙醇沉淀分離

　　【材料儀器】

　　材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（紅葉石楠）

　　儀器：移液槍、電子天平、恒溫水浴箱、高速離心機、EP管、液氮、研磨等。

　　【實驗試劑】

　　抽提緩沖液（2×CTAB溶液）：2％CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1％β-巰基乙醇、

　　0.1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） TE: 10Mm Tris-HCl（pH=8.0），1mM EDTA

　　其他試劑：液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等

　　【實驗操作】

　　取1.0g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干 植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入預冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷，研磨成細粉（越細越好）。

　　轉入加有抽提緩沖液3.0ml的5ml離心管

　　60℃水浴保溫1小時（不時轉動試管）

　　分裝成2個2.mlEP管，15,000 rpm，離心10分鐘

　　取上清轉入另一個新的離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），混合均勻抽提至水乳膠融狀。

　　15,000 rpm離心5分鐘

　　上清液轉移到另一離心管中，加入0.8-1.0倍體積預冷異戊醇 ，-20℃保溫30分鐘－1小時，緩緩混勻DNA成絮狀折出

　　15,000 rpm，離心5分鐘，棄上清

　　DNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗2次

　　揮發盡乙醇后，用200μl TE緩沖液溶解DNA，-20℃凍存。

　　【注意事項】

　　1、使用新鮮、幼嫩的材料，材料應適量。

　　2、如果樣品容易呈粘稠狀，可能含有較多的多糖。

　　3、如果樣品溶液呈棕色，可能含有較多的酚類物質。

　　4、操作過程中避免劇烈振蕩，器件、器皿和試劑需要高溫滅菌。

　　【思考題】

　　1、為什么要用新鮮、幼嫩的植物組織材料？

　　2、為什么在操作過程中避免劇烈振蕩？

　　3、為什么器件、器皿和試劑需要高溫滅菌？

　　4、如何提高提取植物組織DNA的產量？

　　苯酚：作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

　　氯仿：也可使蛋白質變性并加速有機相與液相分層。

　　異戊醇：有助于消除抽提過程中產生的氣泡。

　　CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來

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